发明提供了一种生物反应器原位蒸汽灭菌装置，用于对反应罐灭菌，包括：第一蒸汽进管、空气进管、第三疏水管、排气管、空气阀、第一蒸汽阀、空气过滤器、限流装置、反应罐、第三开关阀、排气阀；其中，反应罐上装设有第一蒸汽进管、空气进管、第三疏水管和排气管，第一蒸汽进管上设置有限流装置和第一蒸汽阀，空气进管上设置有空气阀和空气过滤器；第三疏水管上设置有开关阀，排气管上设置有第三开关阀和排气阀；本发明还提供了一种原位灭菌方法及一种生物反应器；本发明通过将限流装置安装在第一蒸汽进管上，限制了进入的蒸汽量，避免蒸汽导致培养液液面波动引发的逃液现象、降低了空气过滤器内的压力，增加了滤芯的使用寿命、降低了阀门总成本。