本发明公开了一种反铁磁性纳米粒子生物成像探针的制备方法：将乙酰丙酮铁和乙酰丙酮铂溶解在油胺、油酸和二苄醚的混合溶液中，在200～300℃的惰性气氛条件下反应3～60分钟，不良溶剂沉淀，得到油相反铁磁性纳米粒子；将油相反铁磁性纳米粒子采用配体交换法，利用亲水性分子进行亲水表面修饰，得到水相反铁磁性纳米粒子；将水相反铁磁性纳米粒子采用化学连接反应，利用靶向配体进行靶向表面修饰，得到反铁磁性纳米粒子生物成像探针。本发明还公开了上述制备方法制备得到的反铁磁性纳米粒子生物成像探针及其在制备肿瘤磁共振成像造影剂中的应用。该反铁磁性纳米粒子生物成像探针，具备良好的高场磁共振成像效果，能对活体内微小肿瘤进行精准无创检测。