本发明公开了一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，首先得到串联两个sgRNA表达框的中间载体；然后得到pBI121‑MCS‑Cas9；再设计包含两条sgRNA的引物，以所述中间载体为模板进行PCR；最后通过同源重组把PCR产物连入pBI121‑MCS‑Cas9中。通过上述制备方法可制备得到所述植物双靶点CRISPR/Cas9载体，以pBI121载体为骨架载体，依次连接有sgRNA表达框1、sgRNA表达框2和Cas9表达框。本发明的方法提高了双靶点CRISPR/Cas9载体构建的效率，获得所述中间载体和所述pBI121‑MCS‑Cas9载体后，仅需设计一对引物进行一步PCR和一步同源重组即可成功构建双靶点CRISPR/Cas9载体，方便快捷。另外，本发明一次反应仅需20元，只需合成带接头的一对引物，不需额外的引物及其他试剂，显著降低了成本。