本发明公开了缓冲液组合物及其应用，其中，该缓冲液组合物包括：通用缓冲液，所述通用缓冲液包括5‑25mMol通用Tris缓冲液、5‑20mMol通用二价阳离子、75‑150mMol通用一价阳离子、0.05‑2质量％表面活性剂和0.5‑2mMol二硫苏糖醇(DTT)，pH8‑10；以及连接缓冲液，所述连接缓冲液包括33‑66mM连接Tris缓冲液，0.5‑5mM连接二价阳离子、0.5‑10mM二硫苏糖醇(DTT)、5‑15％PEG4000‑8000和0.5‑2mM ATP，pH值为7‑9。由此，该缓冲液组合物能用于多样本的文库构建，并且，反应时间短，转化率高，错配率低。