本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种芦笋RNA聚合酶III型启动子，更具体涉及一种芦笋U6基因启动子AspU6P3，并进一步公开其克隆方法与应用。本发明首次在“蔬菜之王”芦笋栽培种中克隆获得芦笋RNA聚合酶III型启动子‑‑芦笋内源U6启动子AspU6P3，该启动子为芦笋内源RNA聚合酶III型启动子，该启动子具有高效转录活性，可驱动下游sgRNA的表达，并通过芦笋稳定遗传转化体系验证了内源U6启动子AspU6P3的活性及其应用于芦笋CRISPR/Cas9基因编辑系统的可行性，并首次实现了CRISPR/Cas9介导的芦笋基因组靶向编辑。