本发明公开了一种肺小结节良恶性评估的高灵敏度的甲基化检测试剂盒及其应用，属于基因检测技术领域。该试剂盒包括特异性检测人SHOX2和PTGER4基因的DNA甲基化的检测试剂，检测SHOX2和PTGER4甲基化基因的Ct值后，利用算法对肺小结节良恶性进行评估。特别的，本发明还提供了特异性捕获序列，用于提高重亚硫酸氢盐处理后通过目标DNA的回收率。结合多基因联合算法，能够显著提高甲基化检测的阳性检出率和特异性，将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子，提高评估肺小结节良恶性的准确性，进一步提高早期肺癌检测的准确性。