本发明提供一种分子信标、其构建方法及应用。所述分子信标包括：两条寡核苷酸链，其中，所述两条寡核苷酸链中的一条为主链单链，其核苷酸序列包括：5’端连接序列、适配体序列以及3’端连接序列，所述主链单链在5’端和3’端分别标记淬灭基团和荧光基团，或者在5’端和3’端分别标记荧光基团和淬灭基团；另一条为互补短链cDNA，其无任何修饰基团，所述互补短链cDNA包含与所述主链中的5’端连接序列的部分或全部互补的5’端互补序列、和与所述主链中的3’端连接序列的部分或全部互补的3’端互补序列，以使所述淬灭基团和所述荧光基团不分开。所述分子信标在凝血酶的检测中显示出高灵敏性和灵活性。