本发明涉及一种宏基因组文库及建库方法和应用，属于感染病原诊断技术领域。该方法包括以下步骤：S1：提取待测样本中的基因组核酸；S2：在片段化缓冲液体系中加入按照活性单位比1:6‑8的量加入基因组核酸和转座酶复合体，进行片段化和加接头反应；所述片段化缓冲液中包括数均分子量≥20,000的拥挤分子；S3：在S2步骤得到的溶液中直接加入引物和扩增试剂，对文库进行扩增；S4：对扩增后的文库进行纯化，即得。该方法适用于复杂核酸宏基因组条件，应用于临床感染病原诊断。该方法经过严格系统的优化后得出，不仅操作简便，耗时短，还能够提高文库复杂度，富集临床样本中mcfDNA，提高了检测灵敏度，增加了宏基因组对病原检测的灵敏度。