本发明公开了一种均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针的制备方法及其制备的探针和应用，该方法包括制备表面增强拉曼探针A，制备表面增强拉曼探针B，以及将两种探针表面的DNA互补配对形成DNA双链，使得金属纳米粒子的间距减小，形成信号均匀的高灵敏表面增强拉曼探针。本发明利用DNA链的互补配对缩短金属纳米粒子之间的间距，产生均匀而狭窄的纳米间隙，从而提高表面增强拉曼探针的表面增强拉曼散射信号强度，提高表面增强拉曼探针的检测灵敏度和均匀性，本发明制备的探针在复杂环境中的痕量检测具有重要价值，对于丰富生化分析中的检测手段也具有很大的意义。