本发明属于去泛素化酶荧光检测技术领域，具体涉及一种用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法。将介孔硅纳米颗粒分散在含有菲啰啉‑硅的二氯甲烷溶液中反应，得到介孔硅‑菲啰啉纳米颗粒；介孔硅‑菲啰啉纳米颗粒与TbCl3·6H2O在乙醇中混合，回流，加入1,3‑二苯基‑1,3‑丙二酮反应，得到纳米荧光探针前驱体；将纳米荧光探针前驱体悬浮在聚乙烯亚胺水溶液中进行聚乙烯亚胺涂覆，得到聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体；聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体分散在混合溶液中，搅拌，得到纳米荧光探针。本发明的制备过程简单，周期短；制得的纳米荧光探针对UCH‑L1的检测具有良好的灵敏度和选择性。