本发明涉及基因工程领域，公开了D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用。该编码基因为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或者由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和连接在其上的编码标签序列的核苷酸序列组成。D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明提供了一种新型的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，其作为D-阿洛酮糖3-差向异构酶，不依赖于金属离子，并且具有较高的热稳定性。此外，本发明提供的基因为经过优化的编码序列，可高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶，并且得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有极高的生物安全性，可直接用于工业化生产。