本发明涉及一种发酵法制备门冬酰胺酶的方法，包括：(1)种子菌斜面培养；(2)摇瓶培养：将(1)中已长好的斜面菌种接入摇瓶内，振荡培养；(3)种子罐培养：将(2)中已培养好的摇瓶菌种接入种子罐中，在通气条件下搅拌培养；(4)发酵罐培养：将(3)中培养好的种子罐菌种移入发酵罐，接种量为5％‑10％，在通气状态下搅拌培养，然后离心，收集菌体，即得门冬酰胺酶(埃希)菌体；所述发酵罐培养基、种子罐培养基和摇瓶培养基的组分均为：玉米浆、蛋白胨、谷氨酸钠。本发明中门冬酰胺酶表达量大，效价高，并且培养基中没有TSE/BSE风险因子，使得门冬酰胺酶的应用性更好，更加符合法规要求，原料药的成本也可大大降低。