本发明公开了一种分枝杆菌基因工程菌的构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明将重组质粒经转化进入分枝杆菌LY‑1细胞后，sgRNA会识别基因组上的特定区域并引导Cas9蛋白结合到目标位点，在该蛋白的作用下，目标位点处形成一个双链断裂的缺口，绝大多数的细胞因此死亡：随重组质粒引入的同源修复序列在重组酶的作用下通过双交换整合至缺口处，基因同源修复成功的细胞就此存活下来，并形成基因失活和外源基因插入等人工设计的基因型。本发明所构建的CRISPR‑Cas9系统针对同一基因的敲除效率为60％，与现有的分枝杆菌基因编辑方式相比更为便捷和高效。