本发明提供了一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，包括PCR反应液、PCR反应酶系、定量标准品、阳性质控品以及阴性质控品，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、EB病毒和巨细胞病毒特异性的正、反向引物、EB病毒和巨细胞病毒特异性荧光探针；本发明应用实时荧光定量PCR技术，采用多重PCR引物和2种特异性荧光探针，通过双标准曲线法可以实现一个反应中同时对样本中的EB病毒和巨细胞病毒载量进行定值，可实现1管双重的定量检测，可广泛应用于EB病毒和巨细胞病毒相关疾病临床早期诊断、药物疗效、愈后监测及科学研究等多个领域，具有检测半自动化、检测速度快、灵敏高、适用样本范围广的特点。