本发明涉及一种基于单分子力谱探测核酸末端结构的方法，具体是一种用于探测核酸自由末端高级结构的单分子力谱方法，属于生物大分子高级结构的力学精密测量领域。首先通过结合反应将携带修饰基团的待测核酸链锚定于DNA单链引物上，生成分叉引物；其次通过聚合酶链式反应制备携带待测核酸链的DNA以及救生绳DNA片段；再次通过酶切连接生成携带多条待测核酸的救生绳DNA结构物，并将其固定于两个表面之间；最后使用单分子力谱探测待测核酸自由末端形成的高级结构的动态变化。本发明设计的救生绳DNA，主要用于重复、主动、精密和实时测量核酸末端高级结构，拓展了单分子力谱的应用范围。