本发明公开了一种槐糖脂发酵液的预处理与不同结构槐糖脂的分离纯化方法，步骤包括：槐糖脂发酵液的预处理；下层内酯型槐糖脂的收集与处理；板框过滤脱除菌体；树脂吸附及超滤除杂；酸型槐糖脂的纳滤浓缩；干燥。通过选择性采取上述步骤分别获得内酯型、酸型及混合型槐糖脂类液体及固体产品。本发明利用自然沉降法替代传统乙酸乙酯萃取法，利用工业化生产中常用板框过滤替代传统实验室离心法去除菌丝体，利用树脂吸附及超滤法除杂替代实验室及生产中常用的有机溶剂萃取法及醇沉法除杂，成功得到了质量标准优于市售相关产品的槐糖脂。本发明大幅降低了有机试剂的使用量，提高了槐糖脂生产的安全性与环保性。