本发明公开了一种特异性定量检测口蹄疫O型广西株抗原的酶联免疫试剂盒及其应用。该试剂盒包括可以与口蹄疫O型广西株146S抗原特异性结合的单克隆抗体作为捕获抗体包被的酶联反应板和酶标抗体。采用口蹄疫O型广西株(O/GX/09‑7株)的两株特异性单克隆抗体制成的双抗体夹心法酶联免疫定量检测试剂盒，利用本发明试剂盒进行检测与目前口蹄疫其他毒株均不发生交叉反应，灵敏度高、特异性强，可以有效地区分并检测样品中口蹄疫O型广西株(O/GX/09‑7株)抗原的含量。