本发明公开了一种基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法，该方法包括将分布于棉花A亚组或D亚组全基因组26条染色体上的52对核心引物进行多重荧光PCR组合，提取棉花DNA作为待测样品，使用52对核心引物按照多重荧光PCR组合方式组合得到的5个组合分别对待测样品进行pSSR‑PCR扩增反应，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物进行毛细管四色荧光电泳检测与数据分析。本发明能极大地提高检测通量，检测效率高，该方法尤其适用于大批量棉花品种DNA指纹库的构建。