本发明公开了一种重组三价腺病毒疫苗及其构建方法。该重组三价腺病毒疫苗以E3区缺失的人3型腺病毒为基础，以人7型腺病毒的六邻体高变区的中和表位氨基酸的编码片段替换人3型腺病毒中对应的编码片段，并在原缺失的E3区重组入有人55型腺病毒的六邻体全长基因。该重组三价腺病毒疫苗可以诱导小鼠产生较高滴度的抗AD3、AD7、AD55病毒中和抗体，在体内小鼠免疫攻毒保护试验中，该疫苗可以显著保护小鼠遭受严重的AD3、AD7、AD55共三种人腺病毒的感染，明显降低甚至完全清除肺部病毒载量，说明该疫苗候选株具有三价疫苗保护特性。由于该三价疫苗候选株为单一重组腺病毒，免疫原性强，无体内重组风险。