本发明提供了一种用传代细胞系悬浮培养传染性支气管炎病毒的方法，包括：步骤1：取EB66细胞进行复苏与传代培养；步骤2：对步骤1所得EB66细胞进行鸡传染性支气管炎病毒的接种培养；步骤3：接毒后的EB66细胞每隔6-12h进行取样，测定病毒的EID50，在病毒EID50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸡传染性支气管炎病毒。本发明采用EB66细胞作为鸡传染性支气管炎病毒的培养基质，利用提供用全悬浮传代细胞系EB66细胞进行高效的病毒生产，有效提高支气管炎病毒的培育滴度，从而为实现鸡传染性支气管炎病毒疫苗的大规模培养，降低病毒的培育成本。