本发明公开了一种二次固定化合成的含蛋白酶‑无机杂化纳米花的水凝胶型酶催化材料及其制备方法和应用。利用蛋白酶作为有机组分与无机金属离子通过自组装的方式合成蛋白酶‑无机杂化纳米花，然后将其包埋到生物相容性较好的含有至少两种亲水性聚合物的凝胶载体体系中，并通过反复冷冻‑解冻的方法制备得到含有蛋白酶‑无机杂化纳米花的水凝胶，其独特的三维网状结构使酶稳定存在于催化体系中，从而达到二次固定化的目的。本发明通过二次固定化，使蛋白酶免受外界环境的影响，从而使酶的稳定性得到了改善，进一步提高了酶的重复利用性。该催化材料无需与反应物进行分离，省去了酶与底物分离的步骤，在酶的固定化领域将有很广泛的应用前景。