本发明公开了一种制备雷公藤内酯酮的方法。存在于雷公藤中的雷公藤内酯酮、雷公藤甲素、雷公藤乙素和2‑表雷公藤乙素结构非常接近，其中雷公藤乙素和2‑表雷公藤乙素为一对手性异构体，分离难度大。现有技术在分离这四种化合物时，无不依赖于反复硅胶柱层析，然而反复硅胶柱层析耗费溶剂、重现性差，只适合于实验室少量分离，难以在工业生产中推广。目前工业生产中，唯一在使用的柱色谱只有大孔树脂。本发明提供的方法不依赖于反复硅胶柱层析即可分离制备雷公藤内酯酮、雷公藤甲素、雷公藤乙素和2‑表雷公藤乙素。本发明提供的HPLC方法基于常规的C18色谱柱即可有效分离手性异构体雷公藤乙素和2‑表雷公藤乙素，成本低、重复性高。