本发明提供了一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法及其应用，该方法包括：1)使用冷丙酮沉淀疫苗中的蛋白；2)SDS‑PAGE电泳；3)使用灰度扫描仪对各条带进行灰度扫描；4)结合灰度扫描的结果计算疫苗中蛋白含量和纯度。该方法既解决了油乳剂疫苗中抗原蛋白解离效率低且易变性降解的问题，也解决了成品兽用油乳剂蛋白亚单位疫苗的质检中使用靶动物进行实验的难题，在抗原蛋白含量的定量及纯度的检测中准确率达到90％以上；且不会导致抗原蛋白的变性降解且易重复；同时通过对得到的抗原蛋白进行一次SDS‑PAGE检测就能够获得油乳剂蛋白亚单位疫苗中抗原蛋白的含量和纯度的结果，节约了成本、劳动力和时间。