本发明提供一种不含二甲基亚砜的细胞冻存保护液，其组分终浓度为10％‑20％牛血清(v/v)、35％‑50％蔗糖(w/v)、0.15‑0.35mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH值为7.0‑7.4。本发明还提供了一种细胞冻存方法，包括将细胞悬液离心后用本发明的细胞冻存保护液重悬细胞沉淀，当细胞浓度达到104‑107/ml时，按照适应的降温曲线对细胞进行降温处理，至保存于液氮中。本发明的细胞冻存保护液可以使传代细胞在脱离二甲基亚砜条件下完成细胞的冷冻过程，并保证其生物学特性不变，同时避免了二甲基亚砜的毒性作用对其造成的伤害，避免了二甲基亚砜在细胞制备生物制品过程中带来的潜在风险，应用前景良好。