本发明公开了一种结构光照明的双光子荧光显微系统与方法。电光强度调制器、扩束镜和相位调制器沿飞秒激光器发出的光束依次布置在前方，经电光强度调制器功率调制、扩束镜扩束和相位调制器相位调制后入射到扫描模块中，扫描模块的出射光依次经扫描镜、场镜、二色镜和物镜后照射到样品架的样品上，物镜安装在Z向扫描台上；样品被激发的荧光由物镜收集经二色镜反射和滤光片滤波后被光电倍增管探测并转化为电信号，电信号经过解调处理后形成样品的荧光图像。本发明为生物组织深层无创成像提供了一种可行的方式，能得到信噪比大大提升的显微图像，效率高灵敏度强，能够在传统多光子方法无法清楚识别的深度重建衍射极限分辨率。