本发明提供一种快速高效地检测基因组DNA羟甲基化的方法及试剂盒。该方法包括：用限制性内切酶MspI酶切基因组DNA，得到酶切片段；在所述酶切片段的两端分别连接P5接头和P7接头，得到加接头的酶切片段；对所述加接头的酶切片段进行糖基化处理，使其中的羟甲基化碱基转化为糖基羟甲基化碱基，得到包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段；将所述包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段再次用限制性内切酶MspI酶切，得到二次酶切产物；对所述二次酶切产物进行PCR扩增，得到测序用DNA文库；以及，对所述测序用DNA文库进行二代测序。与传统的RRHP方法相比，该方法无需使用包含双脱氧核糖核苷酸的接头。