本发明属于分析化学领域，涉及一种分离测定利伐沙班及其杂质的方法及应用，用于分离测定利伐沙班及其杂质的试剂组合物为：试剂A：加有酸性离子对试剂的无机盐缓冲体系，酸性离子对试剂的浓度为0.2g/L-4.0g/L；试剂B：有机溶剂。采用上述试剂组合物分离测定利伐沙班及其杂质的方法为：取利伐沙班溶于乙腈水溶液得样品溶液；配制流动相；将所述样品溶液注入分离检测系统中，用所述流动相对所述样品溶液进行洗脱分离得洗脱液；所述洗脱液进入检测器测定。本发明能同时将利伐沙班及其杂质完全分离，本方法简单，灵敏度高，分析时间短，专属性强，重现性好，可以同时有效分离及测定利伐沙班原料药及制剂中各有关物质含量。