本发明公开了一种板层角膜基质支架及其制备方法，该方法包括：将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理，并在酶消化处理后进行超声处理，然后再进行干燥和灭菌处理。本发明还提供了所述板层角膜基质支架在作为角膜基质替代物中的应用。本发明的方法最大程度地减少了对角膜基质胶原结构的破坏，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，板层结构保留完整，提高了支架材料的生物相容性。