本发明公开了一种实体荧光纳米微球及其制备方法和应用，属于荧光检测技术领域。本发明的实体荧光纳米微球是由羧基罗丹明B与苯乙炔共价加成得到罗丹明B?苯乙烯，再由罗丹明B?苯乙烯与苯乙烯按照1:1～12的摩尔比聚合而成。本发明将荧光分子嵌入到聚苯乙烯的空间网络中，得到的实体荧光微球具有微球间荧光强弱均匀一致、荧光强度高、信号放大倍数高等特点，由于微球表面没有荧光分子的阻碍，微球能与蛋白进行高效率、高产率的偶联。且该微球产生的荧光背景低，不会影响检测结果的精确性，可广泛应用于诊断试剂中。