本发明涉及一种用荧光二氧化硅纳米颗粒标记的庆大霉素免疫层析试纸及制备方法，免疫层析试纸底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联庆大霉素的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，以及用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液或金黄色葡萄球菌蛋白A溶液印制的隐形对照印迹；荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体采用荧光二氧化硅纳米颗粒标记的庆大霉素抗体制成。本发明的免疫层析试纸简便、快速，实现了庆大霉素的灵敏、快速的现场检测，适用范围广，检测成本低，易于推广应用。