一种确定蚯蚓中土霉素残留浸提剂的实验方法，步骤为：1）将蚯蚓样品与Na2SO4研磨制备组织浆液，用浸提剂清洗得到浸提液；2）经搅拌、振荡、超声提取、低温高速离心分离，收集上清液；3）将上清液过聚四氟乙烯滤膜去除杂质，用高效液相色谱测定土霉素含量；4）分别计算各种浸提剂对土霉素的加标回收率；5）将确定的浸提剂，分别进行一次浸提和二次浸提，通过方差分析确定最佳方案。本发明的优点是：该方法通过实验确定体积比为4:1的甲醇与水的混合液是提取蚯蚓中土霉素的最佳浸提剂；采用该最佳浸提剂在室温下提取一次完全能够达到有效浸提的目的，提取时间短、成本费用低，方法简单、易于实施且提取效率高，易于推广应用。