本发明公开了一种具有抗疲劳作用的火麻仁酶解发酵液及制备方法及用途，制备方法为：(1)配制A液；(2)配制B液；(3)将混合菌种与A液和B液混合，发酵，加氯化钾、氯化铜、核黄素四丁酸酯、磷脂酰丝氨酸，二次接混合菌种，发酵培养，得二次发酵液；(4)向二次发酵液中，加入乳化剂，过滤、均质、巴氏灭活，即获得一种具有抗疲劳作用的火麻仁酶解发酵液。本发明采用生物工程技术使火麻仁所有成分混合酶解和发酵，经与单纯火麻仁蛋白对比，其抗疲劳作用和抗缺氧作用更强。