本发明公开了一种基于光声成像技术的多层介质声速计算的方法，包括以下步骤：根据传感器脉冲响应函数，对传感器接收到的原始数据进行逆滤波处理得到逆滤波数据；设定组织中不同介质的初始声速及声速迭代范围；以逆滤波数据及所设定组织各层声速为基础，进行光声图像重建；从每次重建得到的光声图像中计算并提取图像中声源的分布，依据声源分布信息确定迭代是否完成，若完成则输出声速。本发明提供了一种简单无创的用于测量生物组织中声速的方法，计算简单，复杂度小，效果突出。