本发明公开了一种6-羧基荧光素的制备方法，所述的方法包括以下步骤：a、反应步骤；b、结晶步骤；c、水解步骤。本发明与现有技术相比，使用金属催化剂四氯化锡（SnCl4）选择性催化反应，制备6-羧基荧光素，在分离纯化中选择合适的混合溶剂的比例及纯化方法，将所需产物6-羧基荧光素与副产物5-羧基荧光素比例从1:1提高到2.6:1, 分离产率提高到原来的1.9倍 (从32%提高到61%左右)。大大降低了生产成本，减化了提纯过程，为制备广泛用于荧光标记生物大分子的6-羧基荧光素及其衍生物提供了一种高效实用的新工艺方法，具有很高的应用价值。