本发明公开了一种微生物转化制造25-羟基维生素D的方法。本发明主要采用中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的链霉菌（Streptomycessp.wsbee2009112）对维生素D进行25位羟基转化，保藏编号为CGMCC No.5831。本发明的具体转化方法为：将制备好的孢子悬液接种于培养基中，在转速为200～280rpm、温度为22℃～30℃的摇床上培养2～5天；往培养基中加入由环糊精、维生素D、表面活性剂和有机溶剂混合制成的混合物，继续培养1～10天；经过滤等步骤后得到成品。本发明具有可在维生素D的25位进行直接羟基化、产率高、生产步骤简单、成本低等优点。