本发明涉及一种结核分枝杆菌耐多药检测方法。目的是提供的方法应能同时测定结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药性，具有特异性与灵敏度较高、检测快速以及操作简便的特点。技术方案是：一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其步骤是：A、建立MTB临床菌株和标准菌株H37Rv的PCR模板；B、设计与异烟肼和利福平耐药密切相关katG、inhA和rpoB基因片段的三对引物，同时对临床菌株的katG、inhA和rpoB基因进行mPCR扩增；并对临床菌株和标准菌株H37Rv的katG、inhA和rpoB基因分别进行PCR扩增；C、采用单链构象多态性检测方法同时检测临床菌株耐INH和RFP相关的3个基因的突变情况。