本发明提供一种肠道病毒检测试剂盒，包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品、阳性对照品、阴性对照品。本发明根据CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒的保守区序列设计特异性的引物和探针，采用一步法四重实时荧光定量RT-PCR技术，可快速、准确的从标本中同时检测出CoxB1、CoxB2、CoxB3和其他肠道病毒，并实时准确定量，尤其对属于肠道病毒属的CoxB1、CoxB2、CoxB3进行双重验证，使检测结果更为准确。