本发明公开了一种以L-苏氨酸为底物生产α-酮基丁酸的方法，其中产物α-酮基丁酸是以含合成型L-苏氨酸脱水酶的微生物完整细胞作为生物催化剂，以L-苏氨酸为底物，在20～65℃，pH 7.0～11.0条件下，以50～250转/分钟振荡转化后获得。本发明的方法具有以下特点：(1)采用生物催化的方法，反应体系简单，反应条件温和，步骤简短，操作简便；生物催化剂可以容易地除去，便于后续产物分离纯化；(2)底物L-苏氨酸生成α-酮基丁酸的转化率高，可达99.6％以上，产物α-酮基丁酸可积累到较高浓度；(3)底物L-苏氨酸价格低廉，易于获得。本发明为实现α-酮基丁酸的高效生产奠定了基础。