本发明公开了一种生物油的分子蒸馏分离方法，包括：将生物油原油进行颗粒与水分脱除预处理后获得的预处理后的生物油经分子蒸馏分离过程，在蒸馏温度为常温至200℃，蒸馏压力为10Pa至1800Pa下，获得生物油馏分；以获得的生物油中质馏分为原料，在蒸馏温度为常温至200℃，蒸馏压力为10Pa至1800Pa下，经多次分子蒸馏分离过程，提取生物油馏分内的羧酸类、醛类、酮类、醇类、酚类或糖类化合物。本发明工艺将分子蒸馏分离技术引入热敏性生物油的分离领域，解决了分离过程中生物油品质下降与结焦的问题，可提供特性各异的生物油馏分和多种高附加值化工产品。