本发明涉及水稻稻瘟病抗性基因Pi 25编码区的分离克隆与应用。本发明公开了水稻抗稻瘟病基因Pi 25编码区的核苷酸序列SEQ ID NO.1，及其编码的蛋白质氨基酸序列SEQID NO.2。将Pi 25基因编码区转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用杂交和转化方法在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中连锁累赘问题，并且可以缩短育种时间，提高品种选育效率；抗病基因的克隆是解决传统育种中种间基因转移存在障碍的基础。本发明还提供了用于扩增水稻抗稻瘟病基因Pi25的引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，其中SEQ ID NO：3的核苷酸序列为GGGGTACCCCATCGGCAGTGTAGCGTTTTT，SEQ ID NO：4的核苷酸序列为GCTCTAGAGCGCAATCGTGGAACAGGAAT。本发明还提供了含有水稻稻瘟病抗性基因Pi 25的编码区的载体。