本发明提供了一种繁殖铁皮石斛试管苗的方法，它包括如下步骤：a、选用铁皮石斛茎段或茎段腋芽为外植体，其中茎段或茎段腋芽的叶绿体具有GenBank登录号为：FJ530946的基因序列；b、腋芽成活生长，丛生芽的诱导与增殖，成苗；其中，培养条件是：培养室温度(26±2)℃，光照强度2000lx，pH 5.8~6.0，光源为日光灯或LED光源，每天光照12h。本发明方法是针对目前石斛组织培养方法的不足，对其进行改进，提供一种铁皮石斛种苗快速繁殖的方法，该方法可以在短时间内满足大规模生产所需的种苗，还具有成本低、种苗生长整齐、练苗方法简单易行、遗传稳定性好等特点。