本发明公开了一种使用密闭微孔卡检测结核分支杆菌药敏的方法，包括带有测试微孔的长方形卡体及上盖，测试微孔呈多行、多列的方式均布在卡体上；在卡体上围绕测试微孔开设有环形凹槽，在环形凹槽外的卡体周边处设置有卡槽，上盖周边设置的卡板与所述卡槽相匹配，在上盖的内表面设置有与各微孔相对应的密封凸环。本发明还同时公开了使用该卡检测结核分支杆菌药敏的方法，此方法可以同时对所要检测的结核分枝杆菌临床分离菌株进行菌型鉴定和抗结核药物最小抑制浓度测定，生长指示孔的设定，使得生长速度不同的临床分离株的药敏试验能够顺利完成，保证了结果的可靠性。微孔卡的密封性保证了操作人员的安全。